摘要:目的探讨姜黄素联合白藜芦醇抑制人头颈部肿瘤细胞系增殖的机制。方法用姜黄素和白藜芦醇联合处理Hep2(人喉癌细胞株)及FaDu(人下咽癌细胞株)，应用MTT(塞唑蓝)比色法检测细胞增殖抑制率，平板克隆增殖实验检测单个细胞集落形成能力，Hoechst染色检测细胞凋亡情况，同时应用Ｒeal-timePCＲ法检测Bax和Bcl-2的mＲNA表达水平。结果姜黄素和白藜芦醇对Hep2和FaDu细胞增殖有抑制作用，二者联合处理后，对细胞增殖、细胞克隆形成能力及细胞凋亡的抑制均明显增强;同时，姜黄素和白藜芦醇上调细胞中Bax和下调Bcl-2的mＲNA水平。结论姜黄素与白藜芦醇联合处理可抑制Hep2及FaDu细胞增殖，作用机制可能与上调Bax、下调Bcl-2基因表达有关。
关键词:姜黄素;白藜芦醇;Hep2细胞;FaDu细胞;增殖;凋亡
中图分类号:Ｒ．91文献标志码:A
头颈部恶性肿瘤，特别是喉癌、下咽癌是威胁人类健康常见的恶性肿瘤［1-3］，每年新发病例50万左右。在所有恶性肿瘤中，头颈部肿瘤相关病死率居
第六位［1-2］。姜黄素是姜科植物根茎中的多酚类化合物，具有抗肿瘤、抗氧化以及抗炎等药理作用［4-6］。白藜芦醇也是多酚类化合物，主要来源于
葡萄、花生、桑椹等植物，其生物活性很强，可以作为肿瘤的化学预防剂［7-8］。本研究进一步探讨了姜黄素与白藜芦醇联合作用抑制喉癌细胞及下咽癌细胞增殖，以及诱导细胞凋亡的作用。
1材料与方法
1．1药品与试剂姜黄素(CUＲ，curcumin)，白藜芦醇(ＲES，resveratrol):sigma公司，用二甲基亚砜DMSO溶解，灭菌。使用前用DMEM培养基稀释
成不同浓度，DMSO终浓度小于千分之一。噻唑蓝(MTT)Sigma公司，临用前，用pH7．4的PBS配制成5g/L的溶液。DMEM培养粉:Gibico公司。
1．2细胞培养人喉癌细胞Hep2、下咽癌细胞FaDu购买自美国ATCC(Ｒockville，MD，USA)。细胞维持在含体积分数为10%胎牛血清的DMEM
培养液中，其中加入U/mL的青霉素和μg/mL链霉素。细胞置于37℃、5%CO2的恒温细胞培养箱中培养。1～2d更换一次培养液，待细胞单层长满80%左右时，用0．25%的胰蛋白酶溶液进行消化，离心后收集细胞，按比例传代。
1．3细胞MTT实验取对数生长期的Hep2及FaDu细胞，以个每孔的密度接种于96孔板，37℃、5%CO2培养箱过夜。次日根据实验目的设立空白组及三种实验处理组，用不同浓度的CUＲ(10μmol、20μmol、30μmol、40μmol)，ＲES(10μmol、20μmol、30μmol、40μmol)，以及ＲES(20μmol)+CUＲ(10μmol、20μmol、30μmol、40μmol)联合，每个剂量设定6个平行，药物处理后培养箱培养24h。加MTT，使细胞显色。每孔加入20μLMTT溶液(5mg/mL)，继续培养4h后，倒掉上清液，每孔加入μL的DMSO溶液，微量振荡器振荡10min，使结晶紫充分溶解。酶标仪nm波长处测各孔吸光度值，计算细胞存活率。
1．4细胞平板克隆增殖实验Hep2及FaDu细胞加药(CUＲ10μmol，ＲES20μmol，ＲES20μmol+CUＲ10μmol)处理48h后，分别用0．25%胰蛋白
酶消化吹打成单个细胞悬液，将细胞悬浮在含血清的培养基中备用。每中皿个细胞接种，并轻轻晃动，使细胞分散均匀。将培养皿置于37℃、5%CO2培养箱中培养10d，每2～3d更换新鲜的培养液。经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。倒掉上清液，用PBS小心浸洗3次。用甲醇固定15min。弃去固定液，加入适量的结晶紫染色10min，用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。拍照保存，计数细胞集落数，计算细胞集落形成率。
1．5细胞Hoechst染色实验取对数生长期的Hep2及FaDu细胞，以适当密度接种于6孔板中，37℃、5%CO2培养箱培养过夜，使细胞长满至70%～80%。CUＲ10μmol，ＲES20μmol，ＲES20μmol+CUＲ10μmol处理48h后，按照碧云天生物技术研究所Hoechst染色液操作说明进行(CN:C)。吸尽培养液，加入0．5mL固定液，固定10min，吸尽固定液，用PBS低速摇床清洗两遍，每次3min，吸去PBS，加入0．5mLHoechst
染色液，低速摇床染色5min，吸尽染色液，用PBS低速摇床清洗两遍，每次3min，吸去PBS，滴一滴抗荧光猝灭封片液于6孔板中，染色完成后使用
荧光显微镜以相应波长观察、拍照。使用Image-ProPlus6．0图像处理软件进行分析处理，计算细胞凋亡百分比。
1．6Ｒeal-timePCＲ实验取对数期生长的Hep2及FaDu细胞，按每孔5×个细胞接种于中皿。次日细胞加入，CUＲ10μmol，ＲES20μmol，ＲES
20μmol+CUＲ10μmol继续培养至24h，用TrizolＲeagent提取细胞总ＲNA，经紫外分光光度仪检测Anm/Anm＞1．8，确定ＲNA样本基本无污染。定量后逆转录，逆转录产物在ABI仪器上进行实时荧光定量聚合酶链反应(PCＲ)，以GAPDH为内参照。计算公式为2－△△Ct。在上海Invitrogen公司进行Bax、Bcl-2、GAPDH的引物设计。
Baxsense:5-CGGGGTTATCTCTTGGGC-3，antisense:5-GTGAGAGCCCCGCTGAAC-3，PCＲ产物bp;Bcl-2sense:5-TTATCCAGCTTTTCGG-3，antisense:5-GGCGGCAGATGAATTACAA-3，PCＲ产物bp;GAPDHsense:5-GCTATAGGTGAGGTCGAGAGTC-
3，antisense:5-GAGACGATGGCTGATGATCTCTC-3PCＲ产物bp。
1．7统计学处理应用SPSS16．0软件进行分析。计量资料以珋x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，析因设计资料采用析因方差分析。检验
水准取α=0．05，P＜0．05表示差异有统计学意义。
2结果
2．1姜黄素及白藜芦醇对Hep2和FaDu细胞的增殖抑制作用见图1。终浓度为与对照组相比，10μmol、20μmol、30μmol、40μmol的CUＲ和10μmol、20μmol、30μmol、40μmol的ＲES单独处理Hep2细胞和FaDu细胞24h后，都能明显抑制肿瘤细胞的生存力，具有剂量依赖效应(Hep2细胞中前者F=．6，P＜0．;后者F=70．6，P＜0．;FaDu细胞中前者F=．9，P＜0．，后者F=．8，P＜0．)。与对照组相比，低剂量处理组(20μmol)的抑制效应已较为明显(P＜0．05)，故用20μmol的ＲES与10μmol、20μmol、30μmol、40μmol的CUＲ联合处理对Hep2细胞和FaDu细胞的增殖能力影响。结果显示，CUＲ和ＲES单独处理Hep2细胞和FaDu细胞24h后，明显抑制了肿瘤细胞的生存力，具有剂量依赖效应，细胞生存率见表1，细胞生存率=(实验组OD值/对照组OD值)×%。当二者联合处理后，肿瘤细胞增殖抑制效应表现的更为明显，差异具有统计学意义(Hep2细胞中F=．9，P＜0．;FaDu细胞中F=．6，P＜0．)。提示姜黄素与白藜芦醇的联合作用有进一步的研究意义。
2．2姜黄素及白藜芦醇对Hep2和FaDu单个细胞增殖能力的作用用克隆形成实验检测细胞的克隆形成能力。10μmol的CUＲ，20μmol的ＲES以及20μmol的ＲES加10μmol的CUＲ联合处理对Hep2细胞和FaDu细胞克隆形成能力的影响，见图2。Hep2细胞的集落形成数分别为、、、
23，集落形成率分别为52．0%、47．0%、42．0%、5．8%;FaDu细胞的集落形成数分别为、、、36，集落形成率分别为57．0%、39．0%、38．0%、9．0%。由此可见，10μmol的CUＲ单独处理以及20μmol的ＲES单独处理Hep2细胞和FaDu细胞后，抑制了细胞克隆形成，当二者联合处理肿瘤细胞后克隆形成抑制作用更加明显。
2．3姜黄素及白藜芦醇对Hep2和FaDu细胞的凋亡作用用Hoechst染色检测细胞的凋亡情况。10μmol的CUＲ，20μmol的ＲES以及20μmol的ＲES加10μmol的CUＲ联合处理对Hep2细胞和FaDu细胞凋亡的影响结果见图3。随机观察10个低倍镜视野(×20)，并计算凋亡率。Hep2细胞的处理组凋亡率为(1．1±0．4)%，10μmolCUＲ处理组的凋亡率为(2．7±0．9)%，20μmolＲES处理组的凋亡率为(5．1±1．2)%，联合处理组的凋亡率为(16．1±2．8)%;FaDu细胞的处理组凋亡率为(0．8±0．3)%，10μmolCUＲ处理组的凋亡率为(4．6±1．7)%，20μmolＲES处理组的凋亡率为(7．3±2．6)%，联合处理组的凋亡率为(15．7±3．5)%。结果提示，10μmol的CUＲ单独处理以及20μmol的ＲES单独处理Hep2细胞和FaDu细胞后，促进了细胞凋亡，当二者联合处理肿瘤细胞后，明显诱导了细胞凋亡。
2．4姜黄素及白藜芦醇对Hep2细胞和FaDu细胞Bax及Bcl-2的mＲNA水平的作用用Ｒeal-timePCＲ法检测细胞中相关mＲNA的表达水平。10μmol的CUＲ，20μmol的ＲES以及20μmol的ＲES加10μmol的CUＲ联合处理对Hep2细胞和FaDu细胞凋亡相关因子Bax及Bcl-2的mＲNA水平影响，见图4。10μmol的CUＲ单独处理以及20μmol的ＲES单独处理Hep2细胞和FaDu细胞后，促进了凋亡诱导基因Bax的mＲNA水平，抑制了凋亡抑制基因Bcl-2的mＲNA表达。当二者联合处理肿瘤细胞后，明显上调了Bax的mＲNA水平，下调了Bcl-2的mＲNA水平，具有统计学差异(P＜0．05)，但二者并不是协同作用(主效应P＜0．05，但交互作用P＞0．05)。结果提示，姜黄素与白藜芦醇抑制Hep2细胞和FaDu细胞的增殖，可能与其上调Bax、下调Bcl-2基因表达，从而诱导细胞凋亡有关。
3讨论
目前头颈部肿瘤的治疗方式有手术、放疗、化疗或者联合治疗，在过去的几十年里，手术、放化疗方面研究有大量进展，但其长期预后并不理想。局部复发及远处转移是头颈部肿瘤影响生存率的重要原因［9］。目前很多学者在寻找新的治疗方法来提高生存率、降低复发率、改善生活质量。姜黄素和白藜芦醇是植物多酚类的代表性物质，由于其良好的抗肿瘤、抗氧化、抗炎等作用，而受到了科学家的广泛
本文编辑：佚名
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